Как найти белки продукта

В данном обзоре кратко описаны основные методы определения белка в пищевых продуктах. Указаны основные преимущества и недостатки имеющихся в настоящее время методик и оборудования. Данные обзор может быть полезен для специалистов пищевой промышленности и аналитических лабораторий на производстве продуктов питания. Для простоты восприятия текста при написании обзора авторы сознательно использовали упрощенную лексику и терминологию в описании химических процессов и молекулярной структуры соединений.

1. Введение

Белки (пептиды) представляют собой «полимеры» аминокислот. Белки состоят из двадцати различных аминокислот. Белки отличаются друг от друга в зависимости от типа, количества и последовательности аминокислот, составляющих основу полипептида. В результате они имеют разные молекулярные структуры и физико-химические свойства. Белки являются основными структурными компонентами многих натуральных продуктов, и зачастую определяют их общую текстуру, например, нежность мяса или рыбопродуктов. Изолированные белки часто добавляются в пищевые продукты в качестве ингредиентов, благодаря своим уникальным функциональным свойствам, т. е. их способностью обеспечить внешний вид, структуру или стабильность продукта. Белки нередко используются в процессах гелеобразования, как эмульгаторы, пенообразователи или загустители. Поэтому так важно иметь полную информацию о массовом содержании, типе, молекулярной структуре и функциональных свойствах белков входящих в состав пищевых продуктов.

2. Определение общей концентрации белка

2.1 Метод Кьельдаля

Метод Кьельдаля был разработан в 1883 году пивоваром Иоганном Кьельдалем. Сущность методики заключается в том, что образец продукта разлагается (сжигается) серной кислотой в присутствии катализатора, после чего полученный после разложения связанный в виде сульфата аммония азот может быть определен подходящей методикой титрования. Количество белка рассчитывается в зависимости от концентрации азота в продукте. В таком виде метод все еще используется и сегодня, хотя существует ряд усовершенствований для ускорения процесса и получения более точных данных. Данная методика считается арбитражным методом определения концентрации белка, например, в казеине. Поскольку метод Кьельдаля не измеряет содержание белка напрямую, необходим коэффициент преобразования (К), для перерасчета измеренной концентрации азота в концентрацию белка. Коэффициент 6,25 (что эквивалентно 0,16 г азота на грамм белка) используется для многих приложений, однако, это лишь среднее значение, и каждый белок имеет другой коэффициент преобразования в зависимости от его аминокислотного состава. Подробнее здесь

2.2. Общие принципы.

Метод Кьельдаля удобно разделить на три этапа: сжигание, нейтрализация и титрование.

Разложение. Образец анализируемой пробы взвешивается в специальную колбу, а затем разлагается при нагревании в присутствии серной кислоты (окислитель), безводного сульфата натрия (для ускорения реакции за счет повышения температуры кипения) и катализаторов, таких как медь, селен, титан, или ртуть. При разложении любого азота в продукте (кроме азота, который находится в виде нитратов или нитритов) образуется аммиак, который в растворе сильной серной связывается в ион аммония (NH ₄ ⁺) и, следовательно, остается в растворе. Общий вид реакции будет следующим:

N (food) ® (NH ₄) ₂ SO ₄ (1) N (белков анализируемого продукта) ® (NH _{4) 2} SO ₄ (1)

Нейтрализация. После разложения содержимое колбы количественно переносят в специальную пробирку для отгонки, добавляют щелочь и отгоняют выделяющийся аммиак. Наиболее полно и гладко этот процесс проходит при использовании метода перегонки с паром. Общий вид реакции будет следующим:

(NH ₄) ₂ SO ₄ + 2 NaOH ® 2NH ₃ + 2H ₂ O + Na ₂ SO ₄ (2) (2)

Газообразный аммиак, улавливается в отдельной колбе с избытком раствора бороной кислоты. Низкий рН раствора в колбе способствует переходу газообразного аммиака в ион аммония, и одновременно преобразует борную кислоту в борат ион: Общий вид реакции будет следующим:

NH ₃ + H ₃ BO ₃ (борная кислота) ® NH ₄ ⁺ + H ₂ BO ₃ ^— (Борат ионы) (3)

Титрование. Содержание азота рассчитывается по данным титрования. Борат ионы титруют серной или соляной кислотой, используя подходящий индикатор для определения конечной точки реакции.

H ₂ BO ₃ ^— + H ⁺ → H ₃ BO ₃ (4) H ₂ BO ₃ ^—  + H ⁺ → H ₃ BO ₃ (4)

Концентрации ионов водорода (в молях), необходимое для достижения точки эквивалентности соответствует концентрации азота, в первоначальном образце (уравнение 3). Уравнение (5) может быть использовано для определения концентрации азота в образце, который весит м граммов и для титрования которого потрачено х М соляной кислоты:

(5) (5)

Где V S и V b объемы тирующей кислоты для образца и холостого опыта, 14g — молекулярная масса азота. Холостую пробу, как правило, используют, если требуется принять во внимание остаточный азот, который может содержаться в реагентах, используемых при проведении анализа. Как только содержание азота определено, можно рассчитать содержание белка с использованием соответствующего коэффициента преобразования:

Массовая доля белка = К * % N.

2.3. Преимущества и недостатки

Метод Кьельдаля широко используется в мире и до сих пор наравне со всеми другими методами. Его универсальность, высокая точность и хорошая воспроизводимость сделали его основным методом для оценки содержания белка в пищевых продуктах. Однако этот метод не отражает меру истинного белка, а определяет только общее содержание азота в образце, не выделяя небелковый азот. При этом в ряде случаев неучитывание при расчетах содержания небелкового азота может привести к критичным ошибкам при определении собственно белка. Более того, для различных белков требуются различные коэффициенты преобразования, вследствие отличия в аминокислотных последовательностях. Даже для различных белков одного продукта (например, молочных белков молока) коэффициент может отличаться значительно.

Использования концентрированной серной кислоты при высоких температурах также создает значительную опасность, как и использование некоторых дорогостоящих катализаторов. Кроме этого метод Кьельдаля трудоемок и требует значительного времени для его проведения. В настоящее время для снижения трудоемкости, времени и минимизации случайных ошибок разработаны системы различной степени автоматизации для выполнения всех описанных выше стадий анализа.

3. Метод Дюма

Разработанный и принятый не так давно метод Дюма предназначен для быстрого измерения концентрации белка в пробах продуктов питания. Этот метод впервые описан полтора века назад. Он начинает конкурировать с методом Кьельдаля как арбитражный метод анализа белков для некоторых продуктов питания в первую очередь из-за его оперативности.

3.1. Общие принципы

Образец известной массы сжигается при высокой температуре (около 900^°С) в специальной ячейке в присутствии кислорода. Углекислый газ и вода удаляются путем пропускания газов через специальные колонки, которые поглощают их. Содержание азота измеряется путем передачи оставшегося после очистки газа на делительную колонку, на конце которой имеется детектор по теплопроводности. Дополнительно на колонке отделяется остаточной CO ₂ и H ₂ O. Прибор калибруется путем анализа материала, с известной концентрацией азота, например, ЭДТА (содержание азота 9,59%). После этого, сигнал с детектора по теплопроводности может быть преобразован в содержание азота. Как и для метода Кьельдаля необходимо преобразовывать концентрацию азота в образце, используя подходящие коэффициенты пересчета, которые зависят от точной аминокислотной последовательности белка.

3.2. Преимущества и недостатки

Основное преимущество — это скорость анализа, (по несколько минут на измерение, по сравнению с несколькими часами для Кьельдаля). Метод не требует токсичных химических веществ или катализаторов. Многие образцы могут быть измерены в автоматическом режиме. Метод прост в использовании.

Недостатки: Высокая начальная стоимость. Кроме того, метод также не дает меру истинного белка и для различных белков нужны различные поправочные коэффициенты. Небольшая масса и размер пробы затрудняет получение репрезентативной выборки.

4. Методы с использованием УФ-видимой спектроскопии

Для измерения концентрации белка существует ряд методов, основанных на УФ-видимой спектроскопии. Эти методы используют либо природные способности белков в поглощении (или рассеянии) света в УФ-видимой области электромагнитного спектра, либо предусматривает химическую или физическую модификацию белков, чтобы перевести их в форму, поглощающую (или рассеивающую) свет в этой области. Основные принципы любой из перечисленных ниже методик сходен. Прежде всего, при разработке методики следует выбрать химические группы, которые будут нести ответственность за поглощения или рассеяния излучения, например, пептидные связи, ароматические групп, основные группы для поглощения, для рассеивания — количество агрегированных белков. Далее создается градуировочная (калибровочная) зависимость поглощения (или мутности) от концентрации белка, для чего используются ряд белковых растворов с известной концентрацией. Абсорбцию (или мутность) анализируемой затем пробы определяется по построенной градуировочной зависимости.

Наиболее часто используемые УФ-методики для определения содержания белка в продуктах приводятся ниже:

4.1. Принципы

Прямые измерения при 280 нм. Триптофан и тирозин интенсивно поглощает ультрафиолетовый свет при 280 нм. Во многих белках содержание триптофана и тирозина, остается практически неизменным, так что их поглощения при 280 нм может быть использован для определения их концентрации. Преимущества этого метода в том, что процедура проста для выполнения, метод является неразрушающим, и никаких специальных реагентов не требуется. Основным недостатком является то, что нуклеиновые кислоты поглощают сильно при 280 нм и поэтому могут препятствовать измерению белка, если они присутствуют в достаточной концентрации. Для нивелирования этой проблемы были разработаны методы, в которых поглощение измеряется на двух различных длинах волн.

Биуретовый метод. При взаимодействии ионов меди (Cu ^{2 +)} с пептидными связями в щелочных условиях продукт дает интенсивную фиолетово-пурпурную окраску. Биуретовый реагент, в готовой форме может быть приобретен как готовый реактив в специализированных магазинах. Его смешивают с белковым раствором, а затем выдерживают в течение 15−30 минут и определяют поглощение при 540 нм. Основным преимуществом этого метода это отсутствие помех от других соединений, которые поглощают на более низких волнах, и сама техника менее чувствительны к типу белка, поскольку она использует поглощения с участием пептидных связей, которые являются общими для всех белков, а не с отдельными его группами. Однако, метод имеет относительно низкую чувствительность по сравнению с другими УФ методами.

Метод Лоури. Метод Лоури объединяет биуретовый реагент с другим (реагент Фолина), последний реагирует с остатками тирозина и триптофа в белках. Это дает синеватый цвет, который поглощает в область между 500 — 750 нм в зависимости от того, какая требуется чувствительность. Существует небольшой пик поглощения около 500 нм, который может быть использован для определения высоких концентраций белка и интенсивный пик около 750 нм, который может быть использован для определения низких концентраций белка. Этот метод является более чувствительной к низкому содержанию белков, чем просто метод с биуретовым реактивом.

Методы со связыванием красителя (метод Брэдфорда) Сущность таких методов заключается в добавлении «отрицательно заряженного» красителя в раствор белка, рН которого регулируется так, чтобы белок находился в «положительно заряженной» области (т.е. меньше изоэлектрической точки). При этом белки образуют нерастворимый комплекс с красителем из-за электростатического притяжения между молекулами, а несвязанного краситель остается в растворе. Отрицательно заряженная часть красителя связывается с катионными группами основных аминокислот (гистидина, лизина и арганина) и любыми свободными аминогруппами. Количество несвязанного красителя, остающегося в растворе, после того как нерастворимый комплекс «белок-краситель» удаляется (например, центрифугированием) определяется при измерении его поглощения на соответствующей длине волны. Количество белка, которое присутствовало в исходном растворе пропорционально количеству красителя, добавленному первоначально и оставшемуся в растворе. (Для метода Бредфорда белки и их комплексы с красителем остаются в растворе, меняется интенсивность поглощения (визуально цвет) на анализируемой длине волны).

Турбометрический метод (рассеивание). Любые белковые молекулы, растворимые при обычных условия можно перевести в нерастворимую форму путем добавления определенных химических веществ, например, трихлоруксусной кислоты. Таким образом, концентрация белка может быть определено путем измерения степени мутности пропорциональной рассеиванию проходящего через раствор светового луча.

4.2. Преимущества и недостатки

Преимущества: УФ-видимой методы довольно быстро и просто выполнять, и они чувствительны к низкой концентрации белков.

Недостатки: Для большинства методов УФ-видимой спектроскопии необходимо использовать разбавленные и прозрачные растворы, которые не содержат загрязняющих веществ способных поглощать или рассеивать свет на выбранной для анализа длине волне. Необходимость прозрачного раствора означает, что большинство пищевых продуктов, должны пройти длительную пробоподготовку, прежде чем они будут пригодны для анализа, например, гомогенизация, экстракция, центрифугирование, фильтрация. Такая пробоподготовка может занять много времени и быть чрезвычайно трудоемкий. А иногда бывает невозможно количественно извлечь белки из определенных видов пищевых продуктов, особенно после того, как при обработке белки перешли в агрегированное состояние или образовали ковалентные связи с другими веществами. Кроме того, степень абсорбции зависит от типа анализируемого белка, которые могут отличаться в аминокислотных последовательностях.

5. Другие инструментальные методы

Существуют самые различные инструментальные методы для определения общего содержания белка в пищевых продуктах. Их можно разделить на три категории в соответствии с их физико-химическим принципом: (1) измерение объемных физических свойств, (2) измерения адсорбции излучения, и (3) измерение рассеяния излучения. Каждый инструментальных методов имеет свои преимущества и недостатки, и ассортимент объектов, на которые он может быть применен.

5.1. Принципы

Измерение физических свойств. Плотность: плотность белка больше, чем у большинства других компонентов пищи, таким образом, увеличение плотности пищи, напрямую связано с увеличением содержания белка. Следовательно, содержание белка в продукте может быть соотнесено с его плотностью. Показатель преломления: показатель преломления водных растворов увеличивается при увеличении концентрация белка, следовательно, результаты измерения этого показателя могут быть использованы для определения содержания белка.

Измерение адсорбции УФ-видимый: концентрация белков может быть определено путем измерения поглощения УФ-видимого излучения (подробнее описано выше).

ИК-ближняя и средняя область: Инфракрасные методы могут быть использованы для определения концентрации белков в пищевых продуктах. Белки поглощают в ИК-области за счет собственных молекулярных колебаний (растяжения и изгиба) определенных химических групп вдоль полипептидной цепочки. Таким образом, измеряя поглощение излучения на определенных длинах волн, можно рассчитать количественную концентрацию белка в образце. Он также не требует особой подготовки образца и является неразрушающим методом контроля. Его основные недостатки — высокая начальная стоимость и необходимость проведения комплексной и сложной калибровки.

Измерение рассеяния излучения. Рассеяние света: Концентрация белковых агрегатов в водных растворах может быть определена с помощью методов измерения рассеяния света, поскольку мутность раствора прямо пропорциональна концентрации белка. Ультразвуковое рассеяния: концентрация белковых агрегатов также может быть определена с помощью ультразвуковых методов рассеяния, поскольку скорость ультразвука и его поглощения связанны с концентрацией белка в растворе.

5.2. Преимущества и недостатки

Основные преимущества и недостатки инструментальных методов упоминалось выше. Также следует отметить, для всех этих методов должна существовать калибровочная кривая, которая с большой долей вероятности будет различной для различных типов белков и пищевых матриц, в которых они содержится. Как следствие все инструментальные методы наиболее корректно работают для анализа пищевых продуктов с относительно простыми композициями. Для продуктов питания, которые содержат множество различных компонентов, концентрация которых может варьироваться, определить вклад белка на фоне других компонентов зачастую бывает затруднительно.

6. Выбор метода

При анализе конкретного пищевого продукта обычно всегда возникает задача выбора конкретной методики для измерения концентрации белка в образце. Как решить, какой метод является наиболее подходящим? Первое, с чем нужно определиться это для каких целей будет проводиться анализ. Если анализ будет проводиться для сторонних организаций, с целью проведения сличений, или же для расчета за товар, следует пользоваться официально признанным арбитражным методом. Так Кьельдаль, и все чаще метод Дюма, были официально утверждены для широкого спектра пищевой промышленности. В противоположность этому, только небольшое число методом УФ спектроскопии были признаны официально. Но к примеру, для молока все чаще используется метод Брэдфорда, поскольку определение белка без одновременного определения и учета небелкового азота в молоке может привести к завышенным результатом с неприемлемой ошибкой.

Для целей контроля качества, часто более полезно иметь быстрый и простой метод измерения содержания белка и, следовательно, методы ИК-спектроскопии являются наиболее подходящими. В лабораториях где проводятся фундаментальные исследования, и где обычно работы выдуться с уже выделенными и очищенными образцами, методы с использованием УФ спектроскопии зачастую предпочтительнее, поскольку они дают быстрые и надежные измерения, и чувствительны к крайне низкой (до 0,001% масс.) концентрации белка.

Также следует учитывать и другие факторы, которые, возможно, придется рассматривать. В основном это:

• объем требуемой пробоподготовки
• требуемая чувствительность
• требуемая скорость проведения анализа

Методы Кьельдаля, Дюма, акустические и ИК методы, как правило, не требует специальной пробоподготовки, либо пробопоготовка автоматизирована в соответствующем блоке прибора. Во многих случаях после репрезентативной выборки объект анализируется непосредственно. В противоположность, различные методы УФ спектроскопии, как указано выше, требуют серьезной подготовки образца перед анализом. Белок должен быть сепарирован от образца, что обычно означает различные процедуры гомогенизации, экстракции, фильтрации и центрифугирования. Время, необходимое на анализ, и количество образцов, которые могут быть проанализирован одновременно, также являются важными факторами, которые следует учитывать при определении того, какая методика будет выбрана для анализа.

Другие заслуживающие упоминания факторы — это время амортизации оборудования, его начальная стоимость, наличие или отсутствие требуемого вспомогательного оборудования, стоимость расходных материалов и сроком их годности.

7. Цена вопроса

В заключении приведем ориентировочную стоимость постановки методики[1]:

Дополнительно значительные суммы могут тратиться на проведение пусконаладочных работ, расходные материалы, доставку, обучение персонала, а также сертификацию и метрологическое обеспечение.

[1] Большинство автоматических анализаторов имеют специализированное применение.

[2] Указана стоимость собственно прибора. Калибровки выполняет пользователь, ручная пробоподготовка.

[3] Указана стоимость собственно прибора. Калибровки выполняет пользователь, ручная пробоподготовка.